蛋白A（Protein A）ELISA 檢測試劑盒說明書

貨號：HG-PA001

產品簡介：

BlueKit系列系列蛋白A（Protein A）ELISA檢測試劑盒是用于定量檢測生物制品中蛋白A殘留量的專用試劑盒。

本試劑盒采用雙抗夾心法，用捕獲抗體包被96孔酶標板，制成固相抗體，隨后加入標準品和檢測樣品，再加入辣根過氧化物酶（HRP）標記的酶標抗體，形成一個固相抗體-蛋白A-酶標抗體的三明治結合物，反應結束后洗滌，然后加入底物進行顯色反應，底物在HRP的催化下由無色轉變成藍色，并在終止液的作用下轉變成最終的黃色。在450nm和630nm波長下測定其吸光度值（OD值），其中630nm為校正波長。OD值與樣品中的蛋白A含量呈正相關。

檢測范圍： 5.12 - 500 pg/mL
定  量  限： 5.12 pg/mL
準  確  度： 80% - 120%

規格：

96T

應用：

適用于生物制品純化工藝過程的優化、中間工藝過程的雜質控制以及終產品的放行檢測。

試劑盒組成：

備 注:所有組分存儲溫度均為 2~8℃，有效期12個月。

需自行準備的材料

◆酶標儀

◆去離子水

◆微孔板恒溫振蕩器

◆全新濾紙

◆微量移液器及吸頭

◆渦旋振蕩器

實驗前準備

1.1x樣品稀釋液配制: 取樣品稀釋液（20×）加去離子水稀釋20倍備用，如：取樣品稀釋液（20×）10mL加去離子水190mL混勻。

2.1x 洗液配制：取洗液（20×）加去離子水稀釋20倍備用，如：取洗液（20×）10mL 加去離子水190mL混勻。
（注意：樣品稀釋液（20×）、洗液（20×）中如果有結晶形成，應置于室溫或37℃水浴輕輕搖晃，待結晶完-全溶解后再進行稀釋）

3.顯色液配制：將顯色液A、顯色液B等體積混合，混勻后避光放置。（注：不能放置太久，一般使用前的10min配制。如混合后顯色液已經變藍，請勿使用）。
4.標準品的制備（注：每次實驗需使用新配制的標準品溶液）
試劑盒中放置不同類型的Protein A標準品，請根據所使用的Protein A親和樹脂類型選擇對應的標準品建立標準曲線。若無法獲得對應的Protein A配基，對于重組型樹脂，可使用本試劑盒中的重組Protein A（楚天微球）建立標準曲線；對于耐堿型樹脂，可使用本試劑盒中適用于MabSelect SuRe配基的標準品建立標準曲線。
稀釋過程：用樣品稀釋液（1×）將標準品（50ng/mL）稀釋至500pg/mL，然后系列倍比（稀釋倍數：2.5 倍）稀釋配制標準品，如下圖。

5. 待測樣品稀釋：將樣品恢復至室溫，混勻；使用樣品稀釋液（1×）將樣品進行稀釋。針對不同樣品，需要進行樣品濃度稀釋倍數的驗證。推薦樣品稀釋濃度范圍為0.01-1mg/mL。
6. 加標樣品制備：選擇合適濃度的待測樣品，分為體積相同的3-4份，在其中2-3份樣品中加入不同濃度相同體積的待測物標準品，制備待回收分析樣品。待測物標準品加入體積小于等于總體積的10%，制成2-3 個不同濃度的待回收分析樣品，計算加入的待測物標準品的濃度。

操作步驟

所有操作在室溫（18-25℃）下進行，建議所有加樣孔進行復孔測定。
1.將試劑盒各組分恢復室溫30min，從已平衡至室溫的鋁箔袋中取出試驗所需板條，用記號筆標記板條順序，剩余板條用封板膜封板后重新放回鋁箔袋中，封好，置于2-8℃保存。（注：在洗板過程中板條容易脫落，注意做好標記。）
2.樣品溫育：將制備好的標準品和樣品加入酶標板中（加入順序建議：標準品孔、空白孔、樣品孔、加標樣品孔，標準品按照濃度梯度加入），100µL/孔，用封板膜封板，然后置于37℃、500rpm振蕩溫育1h。（注：加樣時間控制在 10min 以內，避免隨時間出現的漂移。溫育過程中如果不封板或者封板不完-全，會導致反應液蒸發，導致實驗誤差。）
3.洗板：溫育完成后，小心揭去封板膜，棄去孔中液體，用樣品稀釋液（1×）洗板3次（250µL /孔），拍干孔中的殘留液體。（如果洗板方式為手洗，加樣品稀釋液（1×）后可靜置1min；如果采用洗板機洗板，加樣品稀釋液（1×）后可輕微震蕩5s）
4.酶標抗體溫育：加入酶標抗體，100µL/孔，用封板膜封板，然后置于37℃、500rpm振蕩溫育1h。
5.洗板：溫育完成后，小心揭去封板膜，棄去孔中液體，用洗液（1×）洗板3次（250µL /孔），拍干孔中的殘留液體。
6.顯色：將預先配置好的顯色液加入酶標板中，100µL/孔，用封板膜封板，37℃避光靜置溫育15min。
7.終止：加入終止液，100µL/孔，顯色均勻后即可讀數。（注：一般加入終止液后10min內完成）
8.讀數：將酶標板放入酶標儀中，設置波長為雙波長450/630nm，讀取吸光度值。（注：建議在酶標儀讀數程序中設置5-10s的震蕩）。

結果處理

以下標準曲線圖僅供參考，應以同次實驗標準品所繪標準曲線為準。
1.適用于MabSelect SuRe配基標準品的標準曲線

2. 適用于MabSelect PrismA配基標準品的標準曲線

3.重組Protein A（楚天微球）的標準曲線

4.MaXtar^® ARPA ligand Protein A（百林科 Bio-Link）的標準曲線

注意事項

1.樣品首i次檢測，建議進行至少3個連續倍數的稀釋，以在標準曲線范圍內產生至少一個稀釋后樣品。

2.試劑按標簽說明儲存，使用前室溫(18~25℃℃)平衡。3.包被酶標板使用前，請平衡至室溫(18~25°C)再打開外包裝袋，實驗中不用的板條立即放回包裝中密封，4℃可保存一個月。其余不用試劑應包裝好或蓋好。

4.實驗操作中請使用一次性的吸頭，避免交叉污染。

5.使用前檢查試劑盒內各種試劑。試劑稀釋、加樣和終止反應應充分混勻或搖勻對實驗結果尤為重要。

6.洗滌過程中反應孔中殘留的洗滌液應在潔凈的紙中上充分拍干，直至看不到水印。勿將紙巾直接放入反應孔中吸水。

7.底物顯色液對光敏感，避免長時間暴露于光下，避免與金屬接觸影響結果。

8.本產品為一次性使用的試劑盒，請在效期內使用。

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