293T 細胞殘留DNA片段分析檢測試劑盒 (qPCR-熒光探針法)說明書

貨號：HG-HF003

產品簡介：

本試劑盒是用于定量檢測各種生物制品的中間品、半成品及成品中293T細胞DNA殘留片段大小分布的專用試劑盒。
本試劑盒利用PCR熒光探針法原理，定量檢測樣本中293T細胞DNA殘留片段大小分布，本試劑盒設計三種不同的擴增片段（99bp、200bp、307bp），用293T細胞DNA定量參考品分別對不同的擴增片段制作標曲，通過不同大小片段的比值分析樣本中293T細胞殘留DNA的片段分布情況。

規格：

3 × 100 Reactions

產品組成：

產品儲存條件與有限期：

-20℃儲存，有效期 18 個月。

適用機型（包括但不限于）：

◆ ABI PRISM 7500
◆ FQD-96A（博日）
◆ CFX96(Bio-Rad)
◆ Roche Light Cycler 480
配合不同機型使用時，請注意選擇適配的參比染料 ROX

需要準備材料：

◆ 1.5mL 或 2mL 無菌低吸附離心管
◆ 離心機
◆ 熒光定量 PCR 儀
◆ 與 PCR 儀適配的 96 孔 qPCR 板或八聯排管
◆ 震蕩器
◆ 1000μL，200μL，10μL 無菌低吸附帶濾芯槍頭
◆ 各規格移液器（如 1000μL，200μL，10μL，2.5μL 等）

操作步驟：

一、293T DNA定量參考品的稀釋和標準曲線的制備

用試劑盒中提供的 DNA 稀釋液將 293T DNA 定量參考品（濃度為 3ng/μL）進行梯度稀釋，稀釋濃度依次為 3 × 10⁵fg/μL、3 × 10⁴fg/μL、3 ×10³fg/μL、 3 ×10²fg/μL，3 × 10¹ fg/μL。具體操作如下：
1. 將試劑盒中 293T DNA定量參考品和 DNA 稀釋液置于冰上，待完i全融化后，輕微振蕩混勻，短暫離心將液體甩至管底。
2. 取 5 支干凈的 1.5mL 離心管，分別標記為 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5。
3. 在 ST1，ST2，ST3，ST4，ST5 管中分別加入 180μL DNA 稀釋液。
4. 按表 2 依次進行 5 次稀釋操作，每次稀釋后確保充分混勻后再進行下一個梯度的稀釋。如先取 20μL 293T DNA定量參考品加入步驟 3 準備好的 ST1 管中，輕微振蕩充分混勻，短暫離心將液體甩至管底；然后再取 20μL ST1 中的標準品加入步驟 3準備好的 ST2 管中……依次稀釋。

表 2. 標準品稀釋過程

二、陰性質控 NCS 及 NTC 的準備

取 100μL DNA 稀釋液加入 1.5mL 干凈的離心管中，標記為陰性質控 NCS。
陰性質控 NCS 可和同批待測樣本一起進行樣本前處理，制備成陰性質控 NCS 純化液。
qPCR 反應加樣時，加入 10μL DNA 稀釋液即為陰性對照 NTC。
注：為了滿足同步進行三個不同擴增長度的片段分析檢測需求，樣本前處理中 DNA 洗脫體積需要≥ 100μL。

三、加標體系制備

加標回收 ERC：建議 90uL 樣品 +10uLST3，也可根據實際情況按照其他方式制備。
加標回收率計算：ERC 回收率在 50%~150% 之間（加標回收率 =ERC/(0.9* 樣品 +0.1*ST3）

四、qPCR 反應液的制備

1. 從冰箱里取出各試劑置于冰上。
2. 根據所要檢測的標準曲線及待測樣本數量，計算所需反應孔數，一般做 3 個重復孔 / 樣。即反應孔數 =（5 個濃度梯度的標準曲線 + 1 個無模板對照 NTC+ 1 個陰性質控 NCS + 待測樣本數量）×3。
3. 根據反應孔數計算本次所需的 qPCR 反應液總量： qPCR 反應液 =（反應孔數 +2）× 20μL（含有 2 孔的損失量）。
4. 待各試劑放在冰上充分融化后，參考表 3、4、5 所示并組合反應孔數準備對應擴增片段的 qPCR 反應液，并充分混勻。

表 3. 99bp qPCR 反應液配制表

表 4. 200bp qPCR 反應液配制表

表 5. 307bp qPCR 反應液配制表

* 請對應機型選擇適配的 ROX；若機型適配為 no ROX，請加入等體積的去離子水（要求無核酸及核酸酶污染級去離子水）。

五、上樣

1. 將配制的各 qPCR 反應液輕微振蕩混勻，短暫離心將液體甩至管底。按 20μL/ 孔加入排版設計（如表 9 示例或按個人設計調整）對應的孔中，選擇對應擴增片段參考表 6、7、8 所示加樣，加樣后每孔總體積 30μL。

表 6. 99bp 各反應孔加樣示例

表 7. 200bp 各反應孔加樣示例

表 8. 307bp 各反應孔加樣示例

表 9 96 孔板排版示例

& 該示例表示的是檢測 5 個濃度梯度的 DNA 標準曲線、1 個無模板對 NTC、1 個陰性質控 NCS、3 個待測樣本。每個檢測做 3 個重復孔。也可根據自己的使用習慣進行設計排版。

2. 將 96 孔板用光學膜封閉，輕微震蕩混勻，用 96 孔板專用離心機短暫離心裝液體全部甩至管底后放入 qPCR 儀中。

六、上機

以 ABI 公司 7500 qPCR 儀，軟件版本 V2.0.6 為例。
1. 創建空白新程序，選擇絕對定量檢測模板，taqman 探針法。
2. 三組 qPCR 反應液創建新檢測探針，分別命名為 99bp、200bp、307bp，選擇報告熒光基團為 FAM，猝滅熒光基團為 none；創建新檢測探針，命名為 IPC，選擇報告熒光基團為 VIC，猝滅熒光基團為 none，檢測參比熒光為 ROX。
3. 將板上標準品對應的孔選擇為 Standard，分別賦值為 3 x 10⁵、3 x 10⁴、3 x 10³、 3 x 10²，3 x 10¹ （單位為 fg/μL），并且在相應的 Sample Name 一欄中命名為 ST1、ST2、ST3、ST4、ST5；NTC 選擇 Negative Control，NCS 和待測樣品孔選擇為 Unknow，并且在相應的 Sample Name 一欄中命名為 NTC、NCS、S1、S2、S3。
4. 設置三步法反應程序：95℃ 5min；95℃ 15s，58℃ 30s，72℃ 1 min，45 個循環；反應體積 30μL。
5. 運行 PCR 程序。

七、qPCR 結果分析

1. 在 Results 的 Amplification Plot 中，可初步查看擴增曲線的形態是否正常。機器通常會自動設置閾值（Threshold）和基線（Baseline），當 target 設置等不同時可能會出現多個閾值，而導致結果分析有誤，此時請手動設置閾值線，但需確保設置的閾值線在指數擴增區，如通常 Threshold 設置為 0.15，選擇 Auto Baseline，點擊 Analyze，可看到調整后的結果。
2. 數據可靠性分析：
• 三個平行孔間 Ct 值差應小于 1.0，Ct 值大于 35 的孔除外；
• 陰性對照 NTC 和 NCS 的 CT 值都應大于標曲最i低濃度的 CT 值或根據實驗室自身驗證結果設定標準；
• 標準曲線相關系數 R2 ≥ 0.98，擴增效率 85%~110% 之間；
• ERC 回收率在 50%~150% 之間；
3. 以 99bp 片段的待測樣本檢測值為 100%，計算 200bp 片段、307bp 片段的待測樣本百分比。