適用機型（包括但不限于）：

◆ ABl QuantStudio 3 qPCR 儀

◆ 羅氏LC96 Real-Time PCR System

◆ AB1 7500 Real-Time PCR System

◆ 伯樂 CFX Opus96 Real-Time PCR System

◆ 鯤鵬ArchimedTM X Real-Time PCR System

需要準備的耗材與設備：

◆熒光定量 PCR 儀

◆ 1000uL，100uL，10uL移液槍

◆ 1.5mL 無菌離心管

◆ 1000μL，100uL，10μL無菌低吸附帶濾芯吸頭

◆ 無菌無酶八聯管或 96 孔 qPCR 板

試驗流程：

一、 qPCR 反應液的制備和加樣

1、根據所需檢測的標準樣品和待測樣品數量(一般做3 組復孔)，計算反應所需孔數:
反應孔數=(6 組參考品+1個無模板對照 NTC+待測樣品)x3
2、根據反應孔數計算本次所需的 Vero qPCR MIX 總量:
Vero qPCRMIX=(反應孔數+2或3)x20uL(2 或3為操作損失量)
3、將所用試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按下表所示配制Vero qPCR MIX：

4.將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按下表所示加樣(總體積 30uL):

二、 qPCR 反應程序和參數設置

以 BIO-RAD 公司 CFX96 qPCR 儀為例。

1、設置反應程序:

2、創建實驗反應板，點擊 Select Fluorophores 選擇熒光 FAM;在反應板圖表中，選擇樣品孔，在 Sample Type 中下拉選擇 Unknow，勾選熒光 FAM，Target Name 命名為 Vero;輸入每個樣品的重復次數及 Sample Name。

在反應板圖表中，選擇標曲孔，在 Sample Type 中下拉選擇 Standard，勾選熒光 FAM，Target Name 命名為 Vero;輸入每個稀釋梯度的重復次數及SampleName。并且分別在STD1，STD2，STD3，STD4，STD5，STD6的Concentration 一欄賦值為 300000、30000、3000、300、30、3(單位為fg/uL)。

3、點擊 Run 界面的“Start Run"按鈕進行 PCR 測定。

程序 Stage3 中 60°C 30s處設置為熒光收集

三、 qPCR 結果分析

以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例
1. 點擊資料分析視窗Quantitation，可讀取標準曲線的斜率（Slope）、截距（Intercept）、擴增效率（Effect）、R2。
2. 在視窗Quantitation Data 中，SQ Mean 一欄可讀取無模板對照NTC、NCS、待測樣本的檢測值，單位為fg/μL。
3. 陰性對照 NTC和 NCS 的 CT值都應大于標曲最-低濃度的 CT值或根據實驗室自身驗證結果設定標準。

注意事項：

1. 本試劑盒已通過穩定性（凍融等因素）的驗證，無需分裝。

2. 陰性樣品和陽性樣品（參考品和待測樣品等）的配制環境需區分區域，不可在一個區域內操作，配制人員需穿戴整齊，戴好口罩、手套和穿好潔凈服。

3. 注意在不同加樣步驟間及時更換吸頭，避免交叉污染，避免長時開蓋。

4. 試劑盒必須在有效期內使用。

5. 試劑盒內所有組分建議在低溫環境融化后使用。

6. 只有嚴格遵守說明書的操作方法，全部使用本試劑盒配套的試劑才能保證優良檢測效果。

7. 盡量在當天完成樣本前處理純化后立即進行后續qPCR檢測，以保證檢測結果的準確性。

8. 最終的試驗結果與試劑的有效性、操作者的操作方法及試驗環境密切相關。

9. 公司只對試劑盒本身負責，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，預留充足的樣本。

10. 本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷。

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效期保障：嚴格把控產品質量，確保試劑效期新鮮，保障實驗結果的可靠性。

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