K562 feeder cell  殘留檢測試劑盒說明書

貨號： HG-KF001

產品簡介：

基因編輯的K562 細胞因其良好的促進增殖作用而被廣泛研究和使用。研究表明使用基因編輯的K562 細胞作為滋養細胞能使NK細胞的擴增效率提高幾十到上萬倍。在最近的FDA發布的指南文件《Considerations for the Use of Human- and AnimalDerived Materials in the Manufacture of Cellular and Gene Therapy and Tissue-Engineered Medical Products》和藥監局發布的《淺析細胞治療產品中滋養細胞的使用及控制策略》指南文件中，均提及可以使用經過輻照后的K562細胞作為滋養細胞，用于體外培養使用。
盡管K562細胞經過輻照處理，且易被生長的NK 細胞殺死，但仍需確保細胞終產品中盡可能沒有滋養細胞殘留，以保障患者安全。建議研究人員開發靈敏度高的檢測方法，例如反轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）檢測法、微滴式數字聚合酶鏈反應（ddPCR）檢測法等，并對檢測方法進行專屬性、準確性、精密度、檢測限等驗證，以保證檢測方法能對生產過程及終產品進行有效表征，減少對產品質量、臨床療效及安全性的影響。
本試劑盒使用反轉錄聚合酶鏈反應（RTPCR）檢測法，設計特異性的靶標位點，進行K562 feeder cell 殘留檢測。
本試劑盒的檢測范圍：10 copies/μL~ 1×10⁶ copies/μL，K562細胞的最i低檢測限度為0.05%。

應用：

細胞制劑樣本中K562 feeder cell殘留檢測。

規格：

100 Reactions

產品組成：

存儲條件及有效期

-18℃及以下儲存，有效期 18 個月

適用機型（包括但不限于）

◆?ABI PRISM 7500 

 ◆?FQD-96A（博日） 

 ◆?CFX96(Bio-Rad) 

 ◆?Roche Light Cycler 480

• 需自行準備的材料

(1) 熒光定量PCR儀器（包括FAM和VIC熒光通道）

(2) 渦旋振蕩器

(3) 掌上離心機

(4) RNA 提取試劑     

(5) 逆轉錄檢測試劑

(6) 移液器及吸頭     

(7) 八聯排管加蓋或96孔半裙邊板加封口膜

實驗步驟

1.?RNA 提取

取一定量的細胞懸液（1E6-5E6細胞）進行RNA提取

2.?逆轉錄

對提取的細胞RNA進行基因組DNA去除和逆轉錄反應，獲得檢測使用的cDNA。

3.?PCR 擴增

3.1 標準品溶液的配制：

取出定量標準品和DNA稀釋液，置于4℃冰箱中融化；待融化完i全后，上下顛倒混勻20次后，在復合轉子離心機中6000 rpm 離心5秒，用DNA 稀釋液將RNA定量標準品(1E+08 copies/μL)梯度稀釋至1E+06 copies/μL、1E+05 copies/μL、1E+04 copies/μL、1E+03 copies/μL，1E+02 copies/μL，10 copies/μL。具體操作如下：取 7 支 1.5 mL 離心管，分別標記為STD0，STD1，STD2，STD3，STD4，STD5，STD6，參考下表進行稀釋操作（每一步稀釋都需充分震蕩混勻）：

3.2 PCR反應液配置
根據樣本檢測數量計算需要的反應孔數，每個樣本進行3次重復檢測。備注：根據反應孔數計算本次所需的Mix混合液總量：Mix混合液 =（反應孔數+2）× 15 μL（含有2孔的損失量）。在生物安全柜內配制PCR混合液，配置情況如表所示：

備注：如果儀器不需要加ROX，可以將50x ROX 替換為無酶水。
各個反應孔加樣情況如表所示：

3.3 加完樣后，將8聯排蓋子蓋上，先蓋上兩頭的蓋子，再蓋上中間的蓋子，并在蓋子邊 緣做好標記。
3.4 加樣完成密封好管子后，先在復合轉子離心機中6000 rpm離心10秒將管壁的液體離心收集至管底，再置于調節至6檔的旋渦混合器上震蕩10秒以上，完i全混勻反應液，再在復合轉子離心機中6000 rpm離心10秒將管壁的液體離心收集至管底，如有氣泡，需將氣泡排盡。
3.5 PCR程序設置
打開PCR儀，設置PCR反應程序：

3.6 設置樣品反應板：按照PCR反應液加樣位置編輯標準品、NTC、Neg、ERC、待測樣本的信息。在反應板圖表中，選擇樣品孔，在Sample Type中下拉選擇Unknow，勾選熒光FAM，Target Name命名為K562，勾選熒光VIC，Target Name命名ABL，輸入每個樣品的重復次數及Sample Name。輸入每個稀釋梯度的重復次數及Sample Name。并且分別在STD1，STD2，STD3，STD4，STD5，STD6的Concentration一欄賦值為1E+06、1E+05、1E+04、1E+03、1E+02、1E+01，選擇單位（copies/μL）。
3.7 開啟加熱蓋，按照樣品板編輯信息放置八聯管，關閉加熱蓋，啟動PCR運行程序，開始PCR反應。

4.?數據處理

4.1 反應結束后，儀器會自動設置基線和閾值。保存并導出結果。
4.2 利用excel計算結果:將儀器直接導出的檢測結果帶入預先設計好的檢測結果分析表格中，進行最終的檢測結果計算，并將計算的excel表格附件到檢測記錄中。
4.3 計算公式K562 feeder cell 殘留比例 =K562 檢測結果/ABL 檢測結果*100%

5.?系統適用性判定

5.1 三個平行孔間的Ct值變異系數CV%≤5%，Ct值大于35的孔除外。
5.2 空白 NTC 應無Ct值或大于標準曲線最i低濃度2個Ct值。
5.3 PCR 反應擴增效率Effective：85.0%~110.0%，R2≥0.990。

6.?符號及縮寫

6.1 標準品(Standard Products)：STD；
6.2 無模板對照：NTC；
6.3 供試品（Sample）：S。

注意事項

1. 本試劑盒已通過穩定性（凍融等因素）的驗證，無需分裝。
2. 陰性樣品和陽性樣品（參考品和待測樣品等）的配制環境需區分區域，不可在一個區域內操作，配制人員需穿戴整齊，戴 好口罩、手套和穿好潔凈服。
3. 注意在不同加樣步驟間及時更換吸頭，避免交叉污染，避免長時開蓋。
4. 試劑盒必須在有效期內使用。
5. 試劑盒內所有組分建議在低溫環境融化后使用。
6. 只有嚴格遵守說明書的操作方法，全部使用本試劑盒配套的試劑才能保證最佳檢測效果。
7. 盡量在當天完成樣本前處理純化后立即進行后續 qPCR 檢測，以保證檢測結果的準確性。
8. 最終的試驗結果與試劑的有效性、操作者的操作方法及試驗環境密切相關。
9. 公司只對試劑盒本身負責，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量， 預留充足的樣本。
10. 本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷。

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效期保障：嚴格把控產品質量，確保試劑效期新鮮，保障實驗結果的可靠性。

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