貨號： HG-PG001

產品簡介：

PG13細胞系是由小鼠胚胎成纖維細胞（NIH/3T3）整合莫洛尼氏白血病毒（MLV）表達載體和長臂猿白血病病毒（GALV）胞膜蛋白基因改造而獲得的。PG13細胞作為一種包裝細胞目前主要應用于細胞產品（如CAR-T/TCR-T細胞等）的開發。因此相關生物制品需要對其進行PG13細胞DNA殘留的含量進行檢測。

本試劑盒配套有PG13 DNA定量參考品可快速準確定量檢測各種生物制品的中間品、半成品和成品中PG13殘留DNA。

配套樣品前處理試劑盒（貨號為HG-CL100）進行樣品的前處理。

檢測范圍：3 fg/μL ~ 3×10⁵ fg/μL

規格：

100 Reactions

產品組成：

產品儲存條件與有限期：

存儲條件見上表，有效期12個月。開封后未使用完的試劑盒注意仍在規定儲存條件下保存。

適用機型（包括但不限于）：

◆ ABI PRISM 7500
◆ FQD-96A（博日）
◆ CFX96(Bio-Rad)
◆ Roche Light Cycler 480

需要準備的耗材與設備：

實驗前請準備好下列耗材與設備：
◆1.5mL或2mL無菌低吸附離心管
◆ 與PCR儀適配的96孔qPCR板或八聯排管
◆ 1000μL，200μL，10μL無菌低吸附帶濾芯槍頭
◆ 熒光定量PCR儀
◆ 水浴鍋/金屬浴

◆ 離心機
◆ 震蕩器
◆ 各規格移液器（如1000μL，200μL，10μL，2.5μL等）
◆ 磁力架

實驗步驟：

一、 樣品前處理

詳見樣品前處理試劑盒（貨號為HG-CL100）操作說明書。

二、 qPCR操作步驟

1. 定量參考品及NCS、NTC的制備
 1.1 定量參考品：取出 PG13 DNA 定量參考品、DNA 稀釋液置于冰上融化；待完i全融化后，輕微振蕩混勻，瞬時離心；

1.2 取 7 支干凈的 1.5mL 離心管，分別標記為 ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5，ST6；

 1.3 標準品稀釋過程如下表

  1.4 NTC 的制備：100uL DNA 稀釋液；
 1.5 NCS 的制備：取 100uL DNA 稀釋液與樣品同時進行前處理，純化洗脫后的產物即為 NCS；
 1.6 加標回收 ERC：建議 90uL 樣品 +10uL ST3，也可根據實際情況按照其他方式制備。
2. q-PCR 反應液的制備和加樣
 2.1 根據所需檢測的標準樣品和待測樣品數量（一般做 3 個復孔），計算所需孔數：
       反應孔數 =（6 個濃度梯度的標曲 +2 個陰性對照 NTC 和 NCS + 待測樣品）×3
 2.2 根據反應孔數計算本次所需的 qPCR Mix 總量：
       qPCR Mix=（反應孔數 +2 或 3）× 20μL（2 或 3 為操作損失量）
 2.3 將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按下表所示配制 qPCR Mix。

qPCR Mix配制表

3. 將所需試劑置于冰上融化，輕微振蕩混勻，按表4所示加樣（總體積30μL）：

各反應孔加樣示例

4.實驗需使用qPCR實驗專用的八聯管或者96孔板進行反應，需去除反應體系中的氣泡，并離心將液體離至管底準備反應。
5.反應孔排版示例

96孔板排版示例

三、 qPCR反應程序和參數設置

（以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例。）

1.創建實驗反應程序，設置兩步法反應程序如下表：

2.創建實驗反應板，點擊Select Fluorophores選擇熒光FAM；在反應板圖表中，選擇樣品孔，在Sample Type中下拉選擇Unknow，勾選熒光FAM，Target Name命名為PG13-DNA；輸入每個樣品的重復次數及Sample Name。(備注：如儀器要求設置猝滅基團與參比熒光：猝滅基團為None，參比熒光為ROX。)

3.在反應板圖表中，選擇標曲孔，在Sample Type中下拉選擇Standard，勾選熒光FAM，Target Name命名為PG13DNA；輸入每個稀釋梯度的重復次數及Sample Name。分別在ST1、ST2、ST3、ST4、ST5、ST6的Concentration一欄賦值為3.00E+05、3.00E+04、3.00E+03、3.00E+02、3.00E+01、3.00E+00（單位為fg/μL）。

4.點擊Run界面“Start Run"按鈕進行PCR測定。

四、 qPCR結果分析

以BIO-RAD公司CFX96 qPCR儀為例
1. 點擊資料分析視窗Quantitation，可讀取標準曲線的斜率（Slope）、截距（Intercept）、擴增效率（Effect）、R2。
2. 在視窗Quantitation Data 中，SQ Mean 一欄可讀取無模板對照NTC、NCS、待測樣本的檢測值，單位為fg/μL。
3. 數據可靠性評估：
• 三個平行孔間Ct值差應小于1.0，Ct值大于35的孔除外；
• 陰性對照NTC和NCS的CT值都應大于標曲最i低濃度的CT值或根據實驗室自身驗證結果設定標準；
• 標準曲線線性相關系數R2≥0.98，擴增效率85%~110%之間；
• ERC回收率在50%~150%之間（加標回收率=ERC/(0.9*樣品+0.1*ST3)。

注意事項：

1. 本試劑盒已通過穩定性（凍融等因素）的驗證，無需分裝。
2. 陰性樣品和陽性樣品（參考品和待測樣品等）的配制環境需區分區域，不可在一個區域內操作，配制人員需穿戴整齊，戴
好口罩、手套和穿好潔凈服。
3. 注意在不同加樣步驟間及時更換吸頭，避免交叉污染，避免長時開蓋。
4. 試劑盒必須在有效期內使用。
5. 試劑盒內所有組分建議在低溫環境融化后使用。
6. 只有嚴格遵守說明書的操作方法，全部使用本試劑盒配套的試劑才能保證優良檢測效果。
7. 盡量在當天完成樣本前處理純化后立即進行后續qPCR檢測，以保證檢測結果的準確性。
8. 最終的試驗結果與試劑的有效性、操作者的操作方法及試驗環境密切相關。
9. 公司只對試劑盒本身負責，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，
預留充足的樣本。
10. 本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷。

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效期保障：嚴格把控產品質量，確保試劑效期新鮮，保障實驗結果的可靠性。

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