E.coli 殘留總RNA檢測試劑盒 (RT-PCR熒光探針法) 說明書

貨號：HG-ER001

產品簡介：

E.coli 殘留總RNA試劑盒用于定量檢測各種生物制品中大腸桿菌總RNA的殘留情況，輔助進行生物制品的核酸質控。本試劑盒使用RT-PCR熒光探針法原理，將反轉錄和熒光探針qPCR檢測技術融合，可實現一步法定量檢測。通過在大腸桿菌含量高、表達穩定的RNA靶標上，設計特異性引物和探針，通過絕對定量的方法測定總RNA殘留。

規格：

100 Reactions

產品組成：

產品儲存條件與有限期：

所有試劑都于-20℃避光保存與運輸，有效期18個月

實驗步驟：

一、 樣品前處理（需使用試劑盒：HG-CL300）

1.樣品中大腸桿菌（E.coli）RNA殘留檢測作為殘留類的檢測項目，檢測前需要去除供試品中的DNA，因此需要對供試品進行樣本前處理。可選擇使用我司配套的樣本前處理試劑盒，處理方式如下 ：

2. 按照上表方式配置供試品 DNaseI 消化液，震蕩混勻，離心 5s；
3. 將配置完成的供試品 DNaseI 消化液置于 37℃恒溫水浴鍋中孵育 60min；
4. 取出孵育后供試品 DNaseI 消化液，瞬時離心 5s 后置于 65℃干式恒溫器中孵育 10min 滅活 DNase I 酶，將滅活后的供試品DNaseI 消化液放置于 2-8℃冰箱暫存。

二、 qPCR操作步驟

1.定量參考品及NTC制備
1.1 將試劑盒中的大腸桿菌RNA定量標準品和RNA稀釋液置于冰上，待完i全融化后，輕微振蕩混勻，短暫離心將液體甩至管底；
1.2 取6支干凈的1.5mL離心管，分別標記為ST0，ST1，ST2，ST3，ST4，ST5；
1.3按下表進行標準品的梯度稀釋，每次稀釋確保充分混勻后再進行下一個梯度的稀釋。（表格中的體積僅供參考，可根據實際實驗需求等比例擴大）；

1.4 NTC 的制備：100uL RNA 稀釋液。
2.RT-qPCR反應液的制備和加樣
2.1 從冰箱里取出各試劑置于冰上解凍；
2.2 PCR反應液配制：詳見表5，One Step RT-qPCR buffer、One Step Enzyme Mix、E.coli RNA Primer& Probe Mix、ROX，這4種試劑可提前預混成Mix, 再依次加入5μL標曲 (ST1/ST2/ST3/ST4/ST5)、NTC、供試品溶液，混勻。每個樣各做三個平行。
2.3 根據反應孔數計算本次所需的Mix混合液總量：
Mix混合液 =（反應孔數+2）× (10+1+3.6+0.4) μL（含有2孔的損失量）
加樣完成密封好管子后，請先低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，再震蕩混勻5 sec以上，完i全混勻反應液，再低速離心10 sec將管壁的液體離心收集至管底，如有氣泡，需將氣泡排盡。

RT-qPCR反應液配制表

*請對應機型選擇適配的ROX；若機型適配為no ROX，請加入等體積的去離子水（要求無核酸及核酸酶污染級去離子水）。

3. IPC組配制反應液的制備和加樣（如果在檢測中已經有如加標回收等方式，IPC檢測可以取消）每次實驗需做一個無模板對照（IPC-NTC）和各個待測樣本的IPC（IPC-S）檢測，根據下表：

IPC RT-qPCR反應液配制表

備注：
加標體系ERC：90μL 樣品+10μL ST3；
加標回收率=ERC/（0.9*樣品+0.1*ST3）；（加標回收率質控標準：50%~150%）
加標回收與IPC二選一，如選擇加標回收，可將表7中IPC-S更換為ERC-S。

4.反應孔排版示例

備注：該示例表示的是檢測5個濃度梯度的RNA標準曲線、1個無模板對照NTC、3個待測樣本。針對IPC的無模板對照（IPC-NTC）和待測樣本的 IPC（IPC-S1，IPC-S2，IPC-S3）。每個檢測做3個重復孔。實際檢測時可根據樣本多少，參照上表示例進行96孔板排版加樣。
加樣完成后將96孔板用光學膜封閉，輕微震蕩混勻，用96孔板專用離心機短暫離心將液體全部甩至管底后放入qPCR儀中。

三、 反應程序和參數設置

（以ABI公司7500 qPCR儀，軟件版本V2.0.6為例）

1.創建空白新程序，選擇絕對定量檢測模板，taqman探針法。
2.創建新檢測探針，命名為E.coli RNA，選擇報告熒光基團為FAM，猝滅熒光基團為none；創建新檢測探針，命名為RNA IPC，選擇報告熒光基團為VIC，猝滅熒光基團為none；檢測參比熒光為 ROX。
3.設置三步法反應程序如下表：反應體積 20μL。

反應程序

4. 運行PCR程序。

四、 結果分析

1. 在Results 的Amplification Plot 中，可初步查看擴增曲線的形態是否正常。機器通常會自動設置閾值（Threshold ）和基線（Baseline），當target設置等不同時可能會出現多個閾值，而導致結果分析有誤，此時請手動設置閾值線，但需確保設置的閾值線在指數擴增區，如通常Threshold設置為0.15，選Auto Baseline，點擊Analyze，可看到調整后的結果。
2. 在Results的Standard Curve 中，可讀取標準曲線的斜率（Slope）、截距（Intercept）、R2。 可接受標準Effective：85%~110%，R2≥0.98；
3. 在Results 的Report中，Mean Quantity 一欄可讀取無模板對照 NTC、待測樣本的檢測值，單位為fg/μL。NTC的Ct值應大于ST5的Ct值，檢測值應低2fg/μL。
4. 分析IPC的Ct值，正常情況下樣本的Ct-IPC值應該與無模板對照NTC的Ct-IPC值一致或±2。如樣本的Ct-IPC值與無模板對照NTC的Ct-IPC值相比明顯增大，則表明樣本可能存在明顯抑制。
5. E.coli RNA 殘留量計算：
異常數據及檢測過程出現意外情況比如管漏液，樣本蒸發以及樣本加錯等，其產生的數據應刪除，并在檢測記錄中說明原因，其他正常的數據可以繼續應用于檢測結果的計算中

注意事項：

1. 本試劑盒已通過穩定性（凍融等因素）的驗證，無需分裝。
2. 陰性樣品和陽性樣品（參考品和待測樣品等）的配制環境需區分區域，不可在一個區域內操作，配制人員需穿戴整齊，戴
好口罩、手套和穿好潔凈服。
3. 注意在不同加樣步驟間及時更換吸頭，避免交叉污染，避免長時開蓋。
4. 試劑盒必須在有效期內使用。
5. 試劑盒內所有組分建議在低溫環境融化后使用。
6. 只有嚴格遵守說明書的操作方法，全部使用本試劑盒配套的試劑才能保證優良檢測效果。
7. 盡量在當天完成樣本前處理純化后立即進行后續qPCR檢測，以保證檢測結果的準確性。
8. 最終的試驗結果與試劑的有效性、操作者的操作方法及試驗環境密切相關。
9. 公司只對試劑盒本身負責，不對因使用該試劑盒所造成的樣本消耗負責，請使用者使用前充分考慮到樣本的可能使用量，
預留充足的樣本。
10. 本試劑盒僅供體外研究使用，不用于臨床診斷。

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效期保障：嚴格把控產品質量，確保試劑效期新鮮，保障實驗結果的可靠性。

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