為什么培養的細胞要凍存？凍存的通用步驟是什么？有什么注意事項？以上三個問題就是本期我們要探討的內容，

為什么要凍存？

首先，細胞培養過程中，考慮到細胞株傳代次數逐漸增加后，細胞變異的可能性將增大，繼續培養的話細胞株可能會出現老化、狀態下降、丟失一些該細胞的特性的現象，對后續實驗造成影響；

此外，如果該細胞株特別珍貴，屬于實驗室重要資源，對細胞進行大規模的保存，能有效降低課題項目執行的風險;

最后，就是常見的風險規避問題，正所謂人有失手、馬有失蹄，再熟練的實驗操作者、再厲害的實驗設備也是有出問題的可能，一旦出問題，意味著細胞資源的損失。

基于以上幾點，細胞凍存對于一個實驗室或個人來說，是非常必要的操作。

細胞凍存的通用步驟

既然了解了凍存的必要性，接下來我們講一下凍存細胞的通用步驟。這個步驟適用于絕大多數的細胞以及絕大多數的實驗室環境，它并不需要特別的試劑耗材。

當細胞培養至對數生長期晚期，但未進入平臺期之前，也就是生長密度達到90%以上未到100%之前，此時貼壁生長的細胞依然處于單層細胞狀態。將該細胞消化，并進行計數。

然后通過調整細胞懸液體積，將細胞密度調整為2X10^6～2X10^7/mL。與此同時，使用細胞培養級別的DMSO與wan全培養基混合，配制凍存液，凍存液成分的體積比應該為DMSO占20%：wan全培養基80%。

將配置好的凍存液與細胞懸液按照體積1:1的比例進行混合，轉移到凍存管內，做好標記，完成密封。

接下來，按照4度半小時、-20度一小時、-80度過夜的順序逐步將凍存管的溫度下降。

如果實驗室內有程序降溫盒，則可以直接將凍存管放入盒內，實現溫度的穩步下降。最后，將凍存管從-80度轉移至液氮罐內，進行長期保存。

細胞凍存的注意事項

1 在凍存之前，確保細胞狀態良好。包括：細胞生長密度符合上述規定、細胞無污染、細胞形態良好沒有變異。

2 DMSO可以溶解部分濾膜，如果要進行過濾，應該選擇不會被DMSO降解的濾器，并且操作時務必帶手套。

3 凍存管的管蓋并不是擰得越緊越好，因為管蓋內有O型橡膠圈，擰得太緊會讓其變形，造成泄漏。當然，太松也會泄漏。

4 細胞凍存的密度應該要比傳代時的密度要高得多，假如傳代時的密度是1X10^?5/mL，那么凍存時可以將密度提高到100倍。

等到了復蘇后，再將密度稀釋為1/20也依然能保持較高的生長密度，但與此同時，殘留的DMSO對細胞的影響則會大大降低。

5 凍存應遵循慢凍，復蘇則相反，應快速升溫。慢凍的原因是為了避免降溫時，細胞內的水分還未來得及脫離細胞，但卻形成冰晶，對細胞造成損傷。

但也要注意，慢凍不等于無限制的緩慢降溫，因為太慢，也會促成水分形成冰晶。理想的降溫速度應該是1度/分鐘的下降速度。

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以上就是有關細胞凍存的步驟與注意事項，柏萊源生物預祝您試驗成功！